バイオアップロード合同会社は栃木県足利市に所在する専門輸入商社です。米国SoftGenetics社の日本正規代理店として、SoftGenetics社が開発した全ての解析ソフトウェアとその全ライセンスをSoftGenetics社から直接輸入し日本で販売とサポートを行っています。

サンガーシーケンス変異解析ソフトウェア

Mutation Surveyor

DNAフラグメント解析ソフトウェア

GeneMarker

サンガーシーケンス変異解析ソフトウェア

Mutation Surveyor

 

Mutation Surveyor ソフトウェアは、ダイレクトシーケンス、PCRシーケンス、ミトコンドリアDNAシーケンス、リシーケンスプロジェクトにおけるSNPs、Indels、体細胞バリアントなど変異解析に特化したサンガーシーケンス変異解析ソフトウェアパッケージです。特許技術(米国特許 8,086,410)である波形同士を比較しその差異を検出する「アンチ-コリレーションテクノロジー」により、サンプルシーケンス波形データをリファレンスシーケンス波形データと比較し、最大99.5%の正確性とプライマリピークの15%の感度でバリアント検出を実行します。またオプションを選択することにより、プライマリピークの5%の感度で潜在的なマイナーバリアントポジションを検索できます。Applied BiosystemsジェネティックアナライザーやPromega Spectrum Compact CEシステムなど主要なキャピラリーシーケンサーから出力されるABI/AB1ファイル(.abi/.ab1)、SCFファイル(.scf)などのファイル形式に対応しています。優れた正確性、感度、低擬陽性で、最大2,000シーケンスファイルを15分で解析することが可能です。完全GUI(グラフィカルユーザーインターフェース)なのでプログラミングは一切必要ありません。

【動画(47秒)】データのロードとアンチコリレーションテクノロジーによるバリアントコール

「アンチコリレーションテクノロジー」による波形の直接比較

Mutation Surveyorソフトウェアは独自技術の「アンチ-コリレーションテクノロジー」により、サンプルシーケンス波形データとリファレンス波形データの各波形を直接比較してバリアント検出を行います。比較の結果見出されたリファレンスーサンプル間の差異はMutationトレースにトレースされます。

リファレンスの塩基トレースとの差異はMutationピークとしてMutationトレースにトレースされ、各パラメータを満たしたMutationピークのみが塩基置換としてバリアントコールされます。またリファレンスへのアライメント前後におけるピークの移動度を示すMobility LineがIndelコールに利用されます。

 

Mutation Surveyorメイン解析画面

a.png
 

図1:「アンチコリレーションテクノロジー」によるバリアントコール。サンプルシーケンストレースとリファレンストレースの「波形同士」を直接比較して見出された差異は、MutationピークとしてMutationトレースにトレースされます。

 

図2:塩基置換の検出。リファレンスの塩基トレースとの差異は「Mutationピーク」としてMutationトレースにトレースされ、各パラメータを満たしたMutationピークが塩基置換としてバリアントコールされます。

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図3:塩基挿入・欠失の検出。リファレンスへのアライメト前後におけるピークの移動度がMobility Lineに示され、Indelコールに利用されます。図では三塩基欠失の検出。

検出例:ホモ接合性一塩基置換

検出例:ヘテロ接合性一塩基置換

検出例:ホモ接合性挿入

検出例:ホモ接合性欠失

シーケンス波形データからヘテロ接合Indelを自動検出

Indelを含むアレル波形のずれにより2つの波形が重なったシーケンス波形データから、一方のアレルのみに含まれるIndelを自動的に検出します。サンプルシーケンス波形データをリファレンス波形にアライメントし、サンプルシーケンス波形データをリファレンスにマッチする波形(野生型アレル波形)とマッチしない波形(変異型アレル波形)に分離します。分離された変異アレル波形をリファレンス波形へ再アライメントして、挿入・欠失の位置を決定します。(「ヘテロ接合Indel検出原理」参照)

​検出されたヘテロ接合性IndelはMutationテーブルやMutationレポートにレポートされます。MutationテーブルやMutationレポート内のバリアントコールをダブルクリックするとHet Indel Detectionツールが開き、各プロセスの波形を確認できます。⇒動画で見る

 

検出例:ヘテロ接合性挿入・欠失

図:Het Indel Detectionツール。メイン解析画面の3つのトレース(リファレンス/サンプル/Mutationトレース)のほか、サンプルトレースから分離された2つのアレル波形と再アライメントされた波形を閲覧できます。

  C:サンプルトレースから分離された波形①(リファレンスに一致)

  D:サンプルトレースから分離された波形②(BからCを差し引いた残り)

​  D':リファレンスに再アライメントした波形D

  A:リファレンストレース

  B:サンプルトレース

​  E:Mutationトレース

 

【動画(1分16秒)​ヘテロ接合InDel検出とHet Indel Detectionツール

 

ヘテロ接合Indelの検出原理

​以下はHet Indel Detectionツールの各エレクトロフェログラムを分解して、Mutation Surveyorによるヘテロ接合Indel検出の各プロセスを説明したものです。各エレクトロフェログラムに割り当てられているアルファベットは上図のHet Indel Detectionツールのアルファベットに対応しています。

​サンプルトレースBをリファレンストレースAへアライメントします。

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サンプルトレースBから、リファレンスと一致する波形Cと残りの波形Dとに分離します。

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C:サンプルトレースのうち、リファレンスと一致した波形

D:サンプルトレースのうち、リファレンスと一致した波形Cを差し引いた残りの波形

波形Dをリファレンストレースに再アライメントします。以降のバリアント検出プロセスはホモ接合Indel検出と同じ原理です。

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D':リファレンストレースに再アライメントした波形D

​潜在的な低頻度バリアント検出

Mutation Surveyorソフトウェアの特許技術である「アンチコリレーション」テクノロジーは、サンガーシーケンストレース中の体細胞変異やヘテロプラスミー、モザイク現象に関連する潜在的な低頻度バリアントを検出します。サンプルシーケンストレースとリファレンストレースの比較により、サンプルピークとリファレンスピーク間のphysicalな差異を算出して低頻度バリアント候補のポジションをMutationトレースに示します。

アンチコリレーションテクノロジーはリファレンスと比較したサンプルトレースのphysicalな特徴を評価します。physicalな特徴には、シグナルノイズ比やOverlapping factor、Dropping factorが含まれます。体細胞/低頻度アレルはプライマリーピークに大きな変化を生じさせませんが、Mutation Surveyorソフトウェアの感度なら、Mutationトレースに算出された小さなMutationピークインテンシティをモニタリングすることによって、これらのバリアントを検出できます。同じマイナーアレルがフォワード・リバース両方のトレースファイルから検出されると、Mutationトレースのバリアントポジションに緑のバーが表示されます。下の図はTP53遺伝子の5番エクソンに低頻度ピークが検出されたのを表しています。

 

図:Mutation Surveyor ソフトウェアで検出された潜在的な低頻度バリアント(G>GA)。Mutationエレクトロフェログラムの緑のバーは潜在的な低頻度バリアントの存在を示しています。

 

DNAフラグメント解析ソフトウェア

GeneMarker

GeneMarkerソフトウェアは、解析速度、正確性、簡便性を追求したバイオロジスト

に使いやすいDNAフラグメント解析ソフトウェアです。ABI®PRISM、Applied Biosystems SeqStudio™、Promega Spectrum Compact CEシステムなど全てのメジャーなシーケンシングシステムの出力ファイルに対応しており、Amplified Fragment Length Analysis (AFLP®)、 T-RFLPSSR (Short Sequence Repeat)を始めとするマイクロサテライト解析などあらゆるジェノタイピングアプリケーションについて簡便に解析できます。最大1000ジェノタイプデータのバッチ処理が可能です。

【動画(1分58秒)】データのロードとRun Wizardを使ったジェノタイピング

 

3ステップで簡単設定・テンプレートによる自動解析
ピーク検出からサイジング、ジェノタイピングまでを3ステップのガイドに従って実行できます。使用するサイズスタンダードやパネル、解析設定はまとめてテンプレートとして保存し、後の解析でそのテンプレートを使用して簡単、迅速に解析を実行できます(例:マイクロサテライト解析6ローカス40サンプルデータの処理:約3秒)。

RunWizard1枚目のTemplate Selectionボックス(​上図左)では、既存のテンプレートの他、パネルやサイズスタンダード、Analysis Typeを指定します。選択するAnalysis Typeにより2枚目以降のパラメーター値や設定項目が変わります。2枚目のData Processボックスは、Raw Data Analysisセクション、Size Callセクション、Allele Callセクションの3セクションから構成されます。3枚目のAdditional SettingsはAnalysis Typeオプションで選択した解析に依存します。

ジェノタイピング結果のレビュー
ジェノタイピング後のデータはメイン解析ウインドウでレビューできます。メイン解析ウインドウはサンプルファイルツリー(右上図左)、エレクトロフェログラム、ピークテーブル(右図では非表示)、レポートテーブル(同右)で構成され、それぞれ連携して動作します。

サンプルツリーの各サンプル横のマーク(緑、黄、赤)はサイジングのクオリティを、レポートテーブルのアレルコール横のマーク(緑、黄、赤)はソフトウェアによって評価されたアレルコールのクオリティ(Passed、Check、Failed)を表しています。

GeneMarker, フラグメント解析
 

クオリティの低いアレルコールは、レポートテーブルやエレクトロフェログラム上で警告を示す黄色や赤色のアイコンで示され、ピークテーブルのQuality Reason列にその理由が表示されます(右図のCheckピークのQuality Reasonは「SR:Saturated (Repaired)」)。​アレルコールのConfirmや編集は右クリックメニューから行えます。またアレルラベルの表示場所など各表示方法の指定ができます。右図のエレクトロフェログラムでは各マイクロサテライトマーカーを示すボックスを段違いに全て表示し、ピーク高をピーク頂部に表示するよう設定しています。

GeneMarker, フラグメント解析

一画面でサンプルの各ダイカラーのトレースを別々に表示するBrowze by All Colorsや、プロジェクト内の任意のサンプルエレクトロフェログラムを重ね合わせて表示するOverlay Viewツールも利用できます。完全な重ね合わせのほかOffsetバーを使って各サンプルエレクトロフェログラムをずらして表示したり、三次元表示したりすることも可能です。

右図:エレクトロフェログラムのOverlay表示

左上:40サンプルデータの2D Overlay(Offset 0%)

右下:40サンプルデータの2D Overlay(Offset 37%)

​(画像をクリックすると拡大します。)

genemarker
GeneMarker, フラグメント解析

カスタムパネルの作成

カスタムパネルファイルの作成もパネルエディタを使って容易に行えます。Auto作成オプションを使うと、サンプルエレクトロフェログラムの重ね合わせを利用してマーカー範囲やBinを自動定義できます。マウス操作で必要なマーカーやアレルBinを定義するマニュアル作成、またはその両方を用いてカスタムパネルを作成できます。ABIパネルファイル(Panelファイル(.txt)、Binファイル(.txt))をインポートして使用することも可能です。MLPA ( Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification ) 各キットを含む商用キット用の定義済みパネルも提供されます。

GeneMarker, フラグメント解析
 
 

様々なアプリケーションに対応した解析ツールを搭載
GeneMarkerは、GeneProbe®、MRC Holland、Abbott Diagnostics、Asuragen®Fragile X やカスタムケミストリーを利用したアプリケーションなど、様々なアプリケーション用解析モジュールを搭載しています。

GeneMarker, フラグメント解析

MLPA解析モジュール。エレクトロフェログラムでは実験サンプルとコントロールサンプルのピークインテンシティの差が視認できるよう各ピークが重ね合わせて表示されるほか、ピーク比を示すヒストグラムや分布図が表示されます。またMRC Holland社各キット用MLPAパネルがプレロードされています。MLPAパネルにはクオリティコントロールプローブやリファレンスプローブのBinが予め定義されています。

GeneMarker, フラグメント解析

MSI解析レポート。MSI解析モジュールではピークシフトが視認しやすいよう腫瘍部エレクトロフェログラムと正常部エレクトロフェログラムが重ね合わせて表示されます。またマーカー単位の最大ピークに対する相対的ピーク高によるフィルターやStutterピークフィルターにより、典型的なピークシフトや検討を要するピークパターンの検出においてユーザーをサポートします。

Kinship AnalysisツールとRelationship Testingデータベースツール搭載

Relationship Testingデータベースを搭載し、血縁解析が可能です。プロジェクト内やデータベースから同一ジェノタイプのデータを検索したり、血縁関係を持つサンプルデータの検索が可能です。野生生物集団や畜産、水産養殖分野における血縁関係の同定を簡単に行えます。

 

Pedigree Chartツールではエレクトロフェログラムと連携した家系図作成が可能です。家系図内ノードとGeneMarkerで解析したジェノタイプデータを紐付けると、メンデル遺伝則に矛盾するマーカーやローカスをもつノードをソフトウェアが自動的に識別します。家系図内ノードはエレクトロフェログラムとリンクされ、矛盾しているマーカーやローカスは、1クリックで家族メンバーの同じアレルとともにエレクトロフェログラムで確認することが可能です。

GeneMarker, フラグメント解析
 

さまざまな便利機能を搭載

同プロジェクト内リプリケートサンプルのジェノタイピング結果を迅速に比較するReplicate Comparisonツールや、プロジェクト同士を比較するProject Comparisonツールなど解析クオリティと解析速度を向上させるための多くのツールを搭載しています。またユーザーマネジメントシステムを搭載し、GeneMarkerにログインするユーザーのパスワード設定や機能へのアクセス制限設定、情報編集履歴のオーディットトレイルなども可能です。

GeneMarker, フラグメント解析

Replicate Comparisonツール

GeneMarker, フラグメント解析
 

Phylogeny Clusteringツール

動作環境

 

Mutation Surveyor

PC

​OS:Windows®   32または64 bit OS / 8 , 10
CPU:シングルコア以上
動作メモリ:2GB RAM
必要HDD容量:20 GB 空き容量

Intel® Powered Macintosh Computer
OS: 10.4.6(要 Parallels desktop for MAC

もしくは Apple Boot Camp)
Windows®   32 or 64 bit OS
動作メモリ:2GB RAM
必要HDD容量:20 GB 空き容量

※Reference & Tracksマネージャを使用する際は64bitOS、12GBのRAMが必要です。またdbSNPやdbNSFPなど大きなトラックをロードする場合は100GBのHDD空き容量が必要です。

GeneMarker

PC

OS:Windows®   32または64 bit OS / 8 , 10
CPU:シングルコア以上
動作メモリ:2GB RAM
必要HDD容量:20 GB 空き容量

Intel® Powered Macintosh Computer
OS: 10.4.6(要 Parallels desktop for MAC

もしくは Apple Boot Camp)
Windows®   32 or 64 bit OS
動作メモリ:2GB RAM
必要HDD容量:20 GB 空き容量

※ 本製品は研究用です。研究用以外の目的で使用しないでください。

※ 記載の社名および製品名は、SoftGenetics社または各社の商標または登録商標です。