MLPA DNAフラグメント解析

GeneMarkerソフトウェアを使ったMLPA®解析

(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

コピー数多型の検出・レポーティング

MLPA法(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification法)は、迅速でハイスループットなコピー数変化の検出法です。GeneMarkerソフトウェアはネット接続を必要としないインハウスのMLPA解析モジュールを搭載しています。GeneMarkerソフトウェアからMLPAモジュールへ直接接続でき、Rawデータの処理、サンプル正規化、MLPA解析を一つのソフトウェアで実行できます。複数のソフトウェア間でデータを移行する必要はありません。
パワフルなGeneMarkerでは、高速で正確なMLPA解析が可能です。96サンプルのMLPA解析またはMS-MLPA解析をわずか数分で実行可能です。GeneMarkerソフトウェアは、ABI®PRISM、Applied Biosystems® SeqStudio™、Promega Spectrum Compactジェネティックアナライザなど、全てのメジャーなシーケンシングシステムの出力ファイルとカスタムプライマーやカタログケミストリに対応しています。MLPAパネルはGeneMarkerソフトウェアのパネルエディタツールから使用できます。GeneMarkerソフトウェアのMLPAアプリケーションは世界中のResearch Hospitalでバリデーションされており、EuroGentest評価レポートにも含まれています。

動画資料

GeneMarkerソフトウェアでのMLPA解析概要Webinar(英語)

アプリケーションノート

GeneMarkerソフトウェアのMLPAアプリケーション

GeneMarkerソフトウェアのMLPA解析スクリーン

テストサンプル(青いトレース)とノーマルコントロール(赤いトレース)

 
GeneMarker MLPA

画面中央上部のTrace Comparisonには、選択したテストサンプルとリファレンス/コントロールサンプルの正規化されたピークが数bp分ずれて表示されます。そのため、各ピーク高の差を視覚的に確認できます。各プローブのリファレンスーサンプルピーク比はヒストグラム下のRatio Plotにプロットされ、各サンプルについて画面右側のReport Tableにレポートされます(この図では、1つのヘテロ接合欠失と7つのホモ接合重複があります。)。

以下の図1~10はGeneMarkerソフトウェアのMLPA解析ワークフローの詳細です。

MLPAデータの正規化

GeneMarker MLPA
 

図1:GeneMarkerソフトウェアのコントロールプローブ正規化法では、内部コントロール(リファレンス)プローブを使ってピーク高を正規化します。(MRC Holland社はほとんどのケミストリでコントロール(リファレンス)プローブを使った正規化を推奨しています。)この手法はデータの線形性を改善し、解析結果をより正確で不変なものにします。(画像をクリックすると拡大します。)

自動クオリティコントロール

GeneMarker MLPA
 

図2:DフラグメントやQフラグメントを用いたクオリティコントロールは、MLPA解析テンプレートを選択しクオリティコントロールオプションを選択すると自動的に動作します。GeneMarkerソフトウェアでは、クオリティコントロール設定を満たしていない場合は図3のようにユーザーにアラートを発します。(画像をクリックすると拡大します。)

クオリティコントロールアラート

GeneMarker MLPA
 

図3:GeneMarkerソフトウェアは各サンプルの重要なクオリティコントロールフラグメントを自動的に検出し、MRC Holland社の推奨する典型的なフラグメント挙動から外れるフラグメントがある場合、ユーザーにアラートを発します。これらの設定により、簡単に厳密なクオリティコントロールが行えます。

(画像をクリックすると拡大します。)

Saturatedピークの自動検出と自動補正

GeneMarker MLPA
 

図4:Saturation Detection(SD)はSaturatedピークの検出です。検出されたピークはQuality Reasonとして「SD(Saturation Detection)」が与えられ、エレクトロフェログラムの対応する位置に赤い下線が引かれます。SaturatedピークやSaturated/Repairedピークは定量計算に推奨されないため、MLPAアプリケーションに進む際、警告メッセージが開きます。(画像をクリックすると拡大します。)

MLPAアプリケーション移行時のクオリティアラート

 

図5:サンプルにフラグが付いたままのピークコールが存在する場合、これらのフラグを解決する前にMLPAアプリケーションを開こうとするとGeneMarkerソフトウェアはユーザーに警告を発します。この設定はView PreferencesでOn/Offできます。(画像をクリックすると拡大します。)

MLPAレポート

GeneMarker MLPA
 

図6:レポートには各情報を表すヘッダーやエレクトロフェログラム、Ratio Plot、Validationボックス、Report Tableが含まれます。サンプル全体、特定のピーク、特定のピーク群を表示するようカスタマイズできます。自動クオリティコントロール設定を使っている場合、クオリティコントロールフラグメントが閾値をパスしたか失敗したかをレポーティングします。クオリティコントロールフラグメントが閾値をパスしていない場合、レポートに失敗した旨のメッセージが赤文字で表示されます。レポートは直接プリントアウトするほか、PDF、PNG、JPEGファイル形式で保存できます。

(画像をクリックすると拡大します。)

特定プローブのハイライト

GeneMarker MLPA
 

図7:ハイライトすることにより特定のプローブに注目しやすくなります。またこれらのプローブはRatio Plotでは三角のプロットで表示されます。Print Reportでも同様にハイライトされます。

解析設定を簡単にカスタマイズ

GeneMarker MLPA
 

図8:GeneMarkerソフトウェアでは解析設定を簡単にカスタマイズできます。推奨されているデフォルト設定を使って解析することも可能です。左:Run WizardのData Process – MLPA Analysis設定。右:MLPAモジュールの解析設定。(画像をクリックすると拡大します。)

よく使うキット用の解析設定を解析テンプレートとして保存

GeneMarker MLPA
 

図9:解析設定を解析テンプレートとして保存できます。解析テンプレートを使うことにより、3回のクリックでデータ処理を開始でき、解析時間を短縮できます。

施設内ネットワークでパネル、サイズスタンダード、解析テンプレートファイルを共有

GeneMarker MLPA
 

図10:パネルやサイズスタンダード、解析テンプレート用のディレクトリは変更できます。これらのファイルは施設内ネットワーク上でアップデート、保存、共有を簡単に行えます。全てのレポートを同じ場所に保存できるように出力ディレクトリをセットすることも可能です。

(画像をクリックすると拡大します。)

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