第二世代シーケンサーデータ解析ソフトウェア NextGENe

第二世代シーケンサーデータ解析ソフトウェア

NextGENe

NextGENe（ネクストジーン）はIllumina® iSeq、Miniseq、MiSeq、NextSeq、HiSeq、NovaSeqシステムやIon Torrent Ion GeneStudio S5、PGM、Protonシステムなど各プラットフォームから出力されるシーケンスデータのデスクトップ解析用ソフトウェアです。FASTQファイル形式のリードデータを、搭載されているバーコードソーティングツールやシーケンスオペレーションツールを使ってベースクオリティ情報に基づいてリードトリミングやフィルタリング等の前処理後、ファイル形式変換ツールでFASTAファイル形式に変換してからリファレンスへのリードマッピングやアセンブリを行います。FASTAのほかBAMファイルにも対応しており、第二世代シーケンサーから出力される膨大なデータをWindowsマシンで解析できます。バイオロジストにも使いやすいポイント&クリックインターフェースでのNGSデータ解析を可能にします。

マッピングおよびVariant検出のパフォーマンス例（リード前処理、ファイル形式変換後）

NextGENeはNextGENe本体とNextGENe Viewerから構成されています。リシーケンス解析におけるリードファイルのリファレンスゲノムへのマッピングやバリアント検出はNextGENe本体で行います。シンプルなWizard形式で各種設定を行え、解析結果は独自のプロジェクトファイル形式で出力されます。プロジェクトファイルはNextGENe Viewerで展開し、データのアライメント詳細のレビューやバリアントのサンプル間比較やコピー数多型解析などが行えます。またリードファイルからの配列トリミング、低クオリティリードやPCR Duplicateの除去、バーコード配列を用いたソーティングなどリードファイルの前処理は、NextGENe本体の各ツールを用いてリファレンスマッピング前に行います。

カタログやライセンスオプションなどはこちら

NextGENe Project Wizard:

Wizardに従ってリファレンスやリードファイルの指定、アライメント設定やMutation検出設定等各種設定を行えます。使用できる設定オプションは選択したアプリケーションタイプにより変わります。

リファレンスアライメント:

リシーケンス解析では、小さなリファレンスゲノム（250Mbp以下）の場合はFASTA形式かGenBank形式のファイルをリファレンスファイルとして使用します。この場合、リファレンスへのアライメントアルゴリズムはBLAT（BLAST-Like Alignment Tool）に似たアルゴリズムが使用されます。

大きなリファレンスゲノム（250Mbp以上）の場合はSoftGenetics社が提供するプレロードリファレンスを使用します。NextGENe Build Preloaded Referenceツールを使ってカスタムプレロードリファレンスを構築することも可能です。この場合、リファレンスへのアライメントアルゴリズムにはBurrows-Wheeler Transform (BWT)に代表されるSuffix Arrayを使ったPreloaded Index Alignmentアルゴリズムが使用されます。

アプリケーションタイプ

Project Wizardでは選択したアプリケーションタイプにより、使用できる設定オプションやリファンレスタイプが変わります。STR（マイクロサテライト）解析やHLA解析ではカスタムリファレンスFASTAファイルが必要です。

de Novo Assembly
SNV/Indel descovery
Transcriptome with Alternativev splicing
ChIP-Seq
SAGE
STR analysis
CNV-Seq
HLA
Other
Mitchondrial amplicon

リファレンス＆トラックマネージャー（NextGENe）

リファレンスゲノムが250Mbpより大きい場合、SoftGenetics社から提供されるアノテーション付きプレロードリファレンスかカスタムプレロードリファレンスが必要です。より小さいリファレンスではGenBankファイルを使用できます。本ツールでは各プレロードリファレンスやトラックのインポートおよび管理を行います。

本ツールはSoftGenetics社製Mutation Surveyor（ミューテーションサーベイヤー）でも使用します。

プレロードリファレンスリスト

Sequence Operationツール（NextGENe）

ベースクオリティや塩基配列情報によるリードフィルタリングやトリミング、塩基配列やUMI（Unique Molecular Identifier）を用いたPCR Duplicate除去が行えます。その他、リードファイル（FASTQ、FASTAファイル）の分割や統合、溜池サンプリング法によるサブサンプリングなどが行えます。

PCR Duplicate除去（日本語PDF資料）
サブサンプリング（日本語PDF資料）

Sequence Condensationツール（NextGENe）

Condensation ツールでは、カバレッジ深度を使った同一リードの統合やリード数を保持したままベースコールエラーを含むシーケンスリードの補正、リードの伸長を行えます。反復配列を含む過剰なカバレッジを除去したり、リードアセンブリの速度や正確性、RAM消費量が改善されます。

Sequence Condensationツール（日本語PDF資料）

その他ツール（NextGENe）

バーコードソーティング、GC含量計算、ペアエンドリードの統合、リファレンスFASTAファイルから指定したエラー率でIndelなどのバリアントを含む合成データセットの生成、ファイル形式変換など様々なツールがNextGENe本体に搭載されています。

NextGENe Viewer:

Run Wizardの結果を展開し、データレビューおよびサンプル間比較解析などを行えます。マウス操作で拡大縮小表示や左右のスクロールが可能など、SoftGenetics社製ソフトウェア共通の直感的で使いやすいUIです。

プロジェクトのSAM・BAMファイル形式でのエクスポートや、Mutationレポートの各レポート形式での出力、Variant編集のオーディットトレイルなどシーケンス解析に必要な多くの機能を搭載しています。

Comparisonツール（NextGENE Viewer）

以下のComparisonツールを搭載しています。

Expression Comparison
Variant Comaprison
Somatic Mutation Comparison
CNVツール
Batch CNVツール

Variant Comaprisonツールでは同じリファレンスにアライメントした複数プロジェクトのVariant Callを比較できます。Tumor/Normal比較の場合は2プロジェクトの比較を行い、Gain in heterozygosity Variant、Gain in heterozygosity Variant、Absolute change Variantのトップ100をレポートに返します。複数プロジェクト比較では最大20プロジェクトを比較し、全プロジェクトで共通するVariantやカバレッジ条件を満たしたVariant、Variantタイプやロケーションに関わらず複数のプロジェクトで同じ遺伝子上にVariantをもつ遺伝子Variantなど、指定したクライテリアを満たすVariant Callを表示します。

CNVグラフ（NextGENE Viewer）

下図上：バッチCNVグラフ

下図中：CNVグラフ（Dispersion and HMM法）

下図下：CNVグラフ（SNP-Based Normalization with Smoothing法）

（画像をクリックすると拡大します。）

Sensitive Aneuploidy Detection (SAD™) ツール

低カバレッジの全ゲノムシーケンスデータセットから高感度に異数性検出を行うツールです。FASTQファイルおよびBAMファイルに対応しており、自動的にアライメント、リードカウント、GC補正を行います。解析結果は染色体ごとに判定されます。

（画像をクリックすると拡大します。）

STR（マイクロサテライト）解析

予想されるアレル配列を含む各マイクサテライト座位のカスタムリファレンスFASTAファイルが必要です。独自のアライメント設定で各リードを各FASTAファイルのリファレンス配列へアライメントし、STR解析独自のレポート（ローカスレポート・アレルレポート）やグラフ（STRリードヒストグラム）が生成されます。ローカスレポートには座位ごとにアレル数やアレル名、各アレルにマッピングされたリードカバレッジやアレル頻度が表示され、ローカスレポートの各ローカスをクリックすると詳細情報がアレルレポートに表示されます。ヒストグラムではリファレンスアレル配列と完全に一致した場合は赤もしくは青のヒストグラム、SNVを含んで一致した場合はライトレッドやライトブルーのヒストグラムが表示されます。

（画像をクリックすると拡大します。）

アライメント設定では、リファレンスへアライメントされるリードの条件として、リファレンス配列に対する最小リード長を指定できます（左図中ではリファレンスアレル配列の90%以上）。

グローバルビューでは全ローカス・全アレルのカバレッジを俯瞰できます。アライメントビューでは各リード配列を確認できます。アレル配列（反復配列領域）は黄色でハイライトされます。

ミトコンドリアDNAアンプリコン解析

アプリケーションタイプにMitochondrial Amplicon解析を選択すると、リファレンスファイルとしてアノテーション付きミトコンドリアGenBankファイルが必要です。リファレンスがGenBankファイルの場合、アライメントにはBLAT（Blast Like Alignment Tool)に似たアルゴリズムが使用されます。また独自レポートとしてアンプリコンレポート・アレルレポートが生成されます。

NextGENe AutoRunツール（NextGENe）

NextGENeはAutoRunツールを使った完全なバッチ処理が可能です。各ジョブに別々のリファレンスやサンプルデータ、解析設定を選択して、複数プロジェクトのバッチ処理が可能です。RainDance ThunderBolts Cancer PanelやNEBNext Direct BRCA1 and BRCA2の設定済みテンプレートが搭載されています。