サンガーシーケンスバリアント解析ソフトウェア

Mutation Surveyor

Mutation Surveyor （ミューテーションサーベイヤー）ソフトウェアはサンガーシーケンスデータからSNPs、ヘテロ接合Indelを含むIndels、低存在バリアントのコールを自動で行うバリアント解析に特化したサンガーシーケンス解析ソフトウェアです。独自技術であるアンチ・コリレーションテクノロジー（米国特許 8,086,410）を用いてシーケンス波形データの波形を自動で評価し、最大99.5%の正確性とプライマリピークの15%の感度でバリアントコールを実行します。

塩基配列（文字列）に基づいてバリアントを検出する配列解析ソフトウェアではベースコールされないセカンドピークは解析者の視覚的な評価を要しますが、波形を直接評価するMutation Surveyor ではセカンドピークも自動的に評価されバリアントコールが行われます。またオプションを選択することにより、プライマリピークの5%の感度で潜在的なマイナーバリアントポジションを検索することも可能です。

1番上のエレクトロフェログラムはリファレンス（R）、2番目は解析するサンプルのエレクトロフェログラム（S）。1番下のエレクトロフェログラムはリファレンスとサンプルの比較により見出した差異が表示されるMutationエレクトロフェログラム。ベースコールされていないセカンドピーク（上図赤い矢印）もソフトウェアが評価し自動的にバリアントコールを行います。

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一方のアレルにIndelをもち2つの波形が重なったサンプルシーケンス波形データから、リファレンス波形に一致する波形と一致しない波形（Indelを含むと見込まれるアレルの波形）に分離し、ヘテロ接合Indelを自動的に検出。

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Applied Biosystems SeqStudioジェネティックアナライザなど、主要なキャピラリーDNAシーケンサーから出力されるABI/AB1ファイル（.abi/.ab1）などのファイル形式に対応しています。優れた正確性と感度、擬陽性の低さで、最大2,000シーケンスファイルを15分で解析することが可能です。完全GUI（グラフィカルユーザーインターフェース）なのでプログラミングは一切必要ありません。

Mutation Surveyor各機能ページへのリンク

【動画（47秒）】データのロードとアンチコリレーションテクノロジーによるバリアントコール

【動画（76秒）】ヘテロ接合InDel検出とHet Indel Detectionツール

「アンチコリレーションテクノロジー」によるシーケンス波形の直接比較

Mutation Surveyorは独自技術の「アンチ・コリレーションテクノロジー」により、サンプルシーケンス波形データとリファレンス波形データの各波形を直接比較してバリアント検出を行います。比較の結果見出されたリファレンスーサンプル間の差異はMutation Surveyorソフトウェア独自のエレクトロフェログラム「Mutationトレース（エレクトロフェログラム）」（下図3段目）に表示されます。

リファレンス波形データとの差異はMutationピークとしてMutationトレースにトレースされ、各パラメータを満たしたMutationピークのみが塩基置換としてバリアントコールされます。またMutationエレクトロフェログラム中央に引かれた水平の線（下図では緑色）はMobility Lineと呼ばれ、リファレンスとサンプルのシーケンス波形をアライメントした前後のピークの移動度を表しておりIndelsコールに利用されます。

Mutation Surveyor　SeqStudio　ジェネティックアナライザ

リファレンスエレクトロフェログラム（一段目）、解析するサンプルエレクトロフェログラム（二段目）、Mutation エレクトロフェログラム（三段目）。Mutation エレクトロフェログラムにはリファレンスとサンプルのシーケンス波形をアンチコリレーションテクノロジーで比較し見出した差異が表示されます。（画像をクリックすると拡大します。）

変異のバリデーションでのMutation Surveyor使用例：
患者WESで検出された病的変異（CDKL5 c.353A>G）のサンガー法による確認。Mutation Surveyorソフトウェアは、サンガーシーケンス波形データから最大99.5%の正確性とプライマリピークの15%の感度でバリアントコールを行えます。
画像提供：

昭和医科大学医学部小児科学講座　加藤光広先生

低存在率バリアントの可能性のあるポジションを検出

特許技術である「アンチコリレーション」テクノロジーは、サンガーシーケンストレース中の体細胞バリアントやヘテロプラスミー、モザイク現象に関連する低頻度バリアントの可能性のあるポジションを検出できます。モードを変更することで低頻度バリアントの可能性のある５％～の微小ピークを検出します。

低頻度バリアント検出機能については、開発元のWebサイトや資料原文で「低頻度バリアント”の可能性のあるポジション”」または「低頻度バリアント”候補ポジション”」の検出機能と表現されています。これは、本ソフトウェアの頻度15％以上のSNVs判定やIndels判定に対する正確性に対し、本機能はあくまで「低頻度バリアント”の可能性のあるポジション”」を検出する機能であるということを表しています。本機能については購入前に必ずお手持ちのデータでお試しください。⇒35日間フリートライアルの申込み

検出例：微小ピーク（画像をクリックすると拡大します。）

シーケンス波形データからヘテロ接合Indelを自動検出

解析するシーケンス波形データをリファレンス波形にアライメントし、一方のアレルにIndelをもち2つの波形が重なったシーケンス波形データから、リファレンス波形に一致する波形と一致しない波形（Indelを含むと見込まれるアレルの波形）に分離し、ヘテロ接合Indelを自動的に検出することが可能です。ヘテロ接合Indelが検出されると自動的に以下の「Heterozygous Indel Detectionツール」ウインドウが開きますが、任意のシーケンス波形について、手動で「Heterozygous Indel Detectionツール」を使って分離することも可能です。⇒動画で見る

A：リファレンス　B：解析するサンプルシーケンス波形データ、C・D：Bから分離された波形（C：リファレンスと一致する波形、D：リファレンスと一致しない波形）、E：Mutationエレクトロフェログラム

様々なレポート出力

グラフィカルレポート/スタンダードレポート/カスタムレポート

Mutation SurveyorにはMutationプロジェクトの情報詳細を表す様々なグラフィカルベースやテキストベースのレポートやカスタマイズ可能なレポートがあります。これらのレポートは全て、GADの一部または全ての情報についてレポート形式で出力します。また、メインメニューのDisplayメニューから使用できます。これらのレポートは全て、Mutationプロジェクトデータについての重要な情報を表すのにカラフルな凡例を使用しています。これらのレポートはプリントアウトやPDF、Excel、テキスト、画像形式で保存が可能です。

グラフィカルレポートの一例：クリニカルレポート（図をクリックすると拡大します）

カスタムレポート設定（左からFilter設定タブ、Format設定タブ、Nomenclature設定タブ）

（図をクリックすると拡大します）　日本語詳細ページへ移動

ベースパッチ機能によるシーケンスエラー補正

ベースパッチはMutation Surveyor 独自の機能です。この機能によりベースラインノイズを減じたりピークをシャープにしたりすることが可能です。またシーケンストレースのモビリティシフトにおける問題を補正します。

ベースパッチ機能使用時（右）とベースパッチ機能不使用時（左）の2つの解析結果

（ベースパッチ機能以外のパラメーターはすべて同一の設定）

ベースパッチ機能を使用している右図はMutation Electropherogram（最下段）のノイズがベースパッチ機能を使用していない左図より少なく、ベースパッチ機能を使用している右の方がレーンクオリティスコアとPhred-likeスコアも大きくなっています．ベースパッチ機能はトレースクオリティを全体的に向上させ、より良いアライメントとミューテーション検出を行えます．

バリアントナレッジベースとユーザーマネジメントシステム

バリアントナレッジベース

version 5.0からリファレンスゲノム＆バリアントトラック管理ツール（Reference＆Tracksマネージャ）にMutation Surveyorからアクセスして使用できるようになりました。このトラックデータベースを使ってdbSNPやClinVar、dbNSFP、COSMICなど外部バリアントデータベース由来情報のバリアントコールへのアノテーションが可能になりました。（日本語詳細ページへ）

※Reference & Tracksマネージャを使用する際は64bitOS、12GBのRAMが必要です。またdbSNPやdbNSFPなど大きなトラックをロードする場合は100GBのHDD空き容量が必要です。

ユーザーマネジメントシステムとオーディットトレイル

ユーザーマネージメントシステムを使って、管理者によるユーザーパスワード設定や各機能へのアクセス権設定が行えます。権限のないユーザーが誤ってプロジェクトを変更したり、設定済みの解析パラメーターを変えてしまったりすることを防げます。ユーザーマネージメントシステムの搭載により、研究室内の多くの人がソフトウェアを使用することにより生じる混乱が解消され、快適かつ効率的な解析が可能になります。また解析プロジェクトのバリアントコール編集などの履歴がユーザーとともに記録されます。（日本語詳細ページへ　ユーザーマネジメント　オーディットトレイル）

ユーザーマネジメントシステム設定。ユーザーをグループに分け、グループごとに機能へのアクセス権設定が行えます。（図をクリックすると拡大します）

Edit History。プロジェクト内のバリアント編集等の記録がユーザー名や日時とともに記録され、編集前後の値を確認できます。（図をクリックすると拡大します）

ミトコンドリアDNA解析

Mutation SurveyorソフトウェアはミトコンドリアDNA解析にも対応しています。リファレンスとしてミトコンドリアDNAのGenBankファイルをロードすると、GenBankファイルのタグを認識し自動的にミトコンドリアDNAの遺伝コードを採用。環状DNAの開始点/終始点を自動的に認識して正確にアノテーションを行います。ユーザーが手動で修正する必要はありません。（日本語詳細ページへ）

DNAメチレーション解析

Mutation Surveyorは、バイサルファイト処理シーケンスのDNAメチル化解析にも対応しています。目的範囲をカバーするGenBank塩基配列をMutation Surveyorソフトウェアに搭載されているSEQ File Editorツールによりリファレンス用配列へと変換後、変換した塩基配列を元に合成した合成リファレンス波形ファイルと解析するサンプルシーケンス波形ファイルをアンチコリレーションテクノロジーによって比較しメチル化サイトを検出します。

検出結果は表形式のMethylation レポートとグラフィカルなMethylation Graphical Displayで出力可能です。