潜在的な低頻度バリアント検出
アプリケーションノート
図１：Mutation Surveyor ソフトウェアで検出された低頻度バリアント（G>GA）。Mutationトレースの緑のバーは潜在的な低頻度バリアントの存在を示しています。
Mutation Surveyorソフトウェアの特許技術である「アンチコリレーション」テクノロジーは、サンガーシーケンストレース中の体細胞変異やヘテロプラスミー、モザイク現象に関連する低頻度バリアント（バリアントアレル頻度5％～）の可能性のあるポジションを検出できます。アンチコリレーションテクノロジーは、シグナルノイズ比やOverlapping factor、Dropping factorなど、リファレンスと比較して得られるサンプルトレースのphysicalな特徴を評価して低頻度バリアント候補のポジションをMutationトレースに示します。
Mutation Surveyorソフトウェアの感度なら、Mutationトレースに算出された小さなMutationピークインテンシティをモニタリングすることによって、プライマリーピークに大きな変化を生じさせない体細胞/低頻度バリアントを検出できます。フォワード・リバース両方のトレースファイルから同じ低頻度アレルが検出されると、Mutationトレース上の検出位置に緑のバーが表示されます。上の図ではTP53遺伝子のエクソン５にマイナーピークが検出されています。
低頻度バリアント検出機能については、弊社は「低頻度バリアント”の可能性のある”ポジション」または「低頻度バリアント”候補”ポジション」の検出機能と表現しています。これは、本ソフトウェアのSNVsやIndels判定機能の正確性に対し、本機能はあくまで「低頻度バリアント”の可能性のある”ポジション」を検出する機能であるということを表しています。本機能については購入前に必ずお手持ちのデータでお試しください。⇒35日間フリートライアルの申込み（開発元SoftGenetics社のWebサイトに移動します。）
Mutation QuantifierツールによるメジャーピークとマイナーピークのContribution算出
図２：Mutation Quantifierレポートは各アレルのContributionを表示します。この例の低頻度バリアントはフォワード・リバース両方のトレースで、マイナー（Mutant）ピークのContributionが６%近くを示しています。
本ソフトウェアのMutation Quantifierツールは、2つの手法を使ってメジャーアレルとマイナーアレルのContributionを自動的に計算します。Standardized Allele Ratio法はノーマルインテンシティの減少パーセンテージとマイナー（Mutant）インテンシティの増加パーセンテージを算出します。Simplified Allele Ratio法では、RFU値を用いてメジャーアレルとマイナーアレルの相対的なContributionパーセンテージを算出します。図2のSimplified Allele Ratioレポートはこのサンプル中の低頻度バリアントがプライマリーピークのわずか6%のContributionで検出されたことを示しています。
図３：Mutation Quantifierツールのエレクトロフェログラムウインドウに表示されたメジャーアレルとマイナーアレル。エレクトロフェログラムウインドウにフォワードトレース（上図左）とリバーストレース（上図右）それぞれのメジャーアレルとマイナーアレルが表示されています。
フレキシブルな低頻度バリアントのレポーティングオプション
図４：カスタムレポートに、低頻度バリアント候補ポジションが緑色の背景でリストアップされています。カラー設定のカスタマイズも可能で、Mutationはマウスクリックで編集できます。
検出した低頻度バリアント候補ポジションは、標準のMutationレポートやMutationテーブルには出力されませんが、カスタムレポートにレポーティングできます。カスタムレポートはメイン画面（Graphic Analysis Display）と連動しており、カスタムレポート上のバリアントをダブルクリックすると、そのポジションのメイン画面が開き、MutationエレクトロフェログラムのMutationピークを確認できます。